1. The real-time PCR primer and probe set(s) which can be used to distinguish between 2009 Swine-Origin Influenza A (H1N1)from other influenza subtypes.
Please also describe what are gene(s)/region(s) that you choose? And give us the reason why?
Step 1: Search for mRNA sequence and amino acid sequnce of hemagglutinin (HA) of swine influenza from GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) by chosse
Search : Nuecleotide
for : H1N1 HA
Step 2: And then chosse tab mRNA (mRNA: 178) will recieve data GenBank of HA ดas the picture and chosse of Swine 2009 2 type and other 3 type by GenBank accession number
2009:
Swine Rio de Janeiro: CY054281.1
Swine Nebraska: S67220.1
other:
NWS(1996): U08903.1
Alberta(2006): U47310.1
Ws(1996): U08904.1
Step 3: bring FASTA of Amino acid put in ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) and then click run
Step 4: เมื่อพิจารณาจะได้ส่วนที่ 2009 ต่างกับตัวอื่น จะพบว่า amino acid ตำแหน่งที่ 201-254 ต่างออกไป
Step 5: นำ FASTA ของ mRNA ใส่ลงในหน้าของ ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) แล้วกด run
Step 6: เลือก nucleotide sequnce ตำแหน่งที่ 624-762 สำหรับออกแบบ real-time PCR primer และ probe
Step 7: เปิดหน้า Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) แล้วใส่ sequnce ทีี่เลือกไว้จาก step 6 ลงไป และตั้งค่าตามด้านล่าง แล้วจึงกด Pick primers
ส่วนของ Primer:
Product size ranges: 50-90, 80-120 bp
Primer size: min 19 bp, opt 20 bp, max 23 bp
Primer Tm: min 60 , opt 64 , 68
Primer CG%: min 35, max 65
ส่วนของ Probe (Hyb Oligo):
Hyb Oligo excluded region: 47,4 98,8
Hyb Oligo size: min 20 bp, opt 23 bp, max 26 bp
Hyb Oligo Tm: min 68 , opt 70 , max 70
Hyb Oligo GC%: min 20, opt 60, max 80
Step 8: จากนั้นจะได้ primers และ probe ที่ออกแบบมาดังภาพ โดยมีข้อมูลดังนี้
Forward primer: GGGGTCATCAAGATACAGCAAGA, Tm 62.58 , %GC 47.83
Reverse primer: CATTCTCCCTTCTTGATCCCTCA, Tm 63.82, %GC 47.83
Probe: CAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCA, Tm 68.59 , %GC 46.15
2. The conventional PCR and sequencing primer set which can be used to identify oseltamivir resistance associated NA gene mutations: N1: H274Y
Step 9: หา nucleotide sequence ของ neuraminidase จาก GenBank โดยจะได้ GenBank accession number ดังนี้
swine-originated influenza neuraminidase: GU371257.1
oseltamivir resistance: GU371269.1
Step 10: จากนั้นนำ amino acid sequence ใส่ลงในหน้าของ ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) แล้วกด run เช่นเดียวกับ step 3
Step 11: จะได้ผลดังภาพ จะเห็นว่า H ที่ตำแหน่ง 274 เปลี่ยนเป็น Y ใน H274Y
Step 12: นำ FASTA ของ mRNA ใส่ลงในหน้าของ ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) แล้วกด run
Step 13: จะได้ผลออกมา จะพบว่ามีการเปลี่ยนแปลงของ C ที่ตำแหน่ง 828 จึงเลือก sequence ที่ครอบคลุมช่วงนี้
Step 14: เปิดหน้า Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) แล้วใส่ mRNA sequence ของ NA ลงไป และตั้งค่าตามด้านล่าง แล้วจึงกด Pick primers
Targets: 825,5
Product size ranges: 150-250, 100-300 bp
Primer size: min 20 bp, opt 23, max 25
Primer Tm: min 55 , opt 60 , max 75
Primer GC%: min 40, opt 50, max 60
Step 15: จากนั้นจะได้ sequencing primers ที่ออกแบบมาดังภาพ โดยมีข้อมูลดังนี้
Forward primer: CAGGCCTCATACAAGATCTTCAG, Tm 60.27 , %GC 47.83
Reverse primer: CCAGATTCTGATTGAAAGACACC, Tm 59.99 , %GC 43.48
Step 16: ออกแบบ conventional PCR primers ซึ่งมีค่าที่ต้องตั้งต่างจาก sequencing primers โดยทำ Step 14 อีกครั้ง แต่เปลี่ยนการตั้งค่าเป็น
Product size ranges: 250-300 300-400 400-500 bp
Primer size: min 18 bp, opt 20 bp, max 22 bp
Primer Tm: min 52 , opt 55 , max 58
Primer GC%: min 40, opt 50, max 60
Step 17: จากนั้นจะได้ conventional PCR primers และ probe ที่ออกแบบมาดังภาพ โดยมีข้อมูลดังนี้
Forward primer: GAATGTGCATGTGTAAATGG, 20mers, Tm 54.81 , %GC 40.00
Reverse primer: TCCCACTGCATATGTATCCT, 20 mers, Tm 55.46 , %GC 45.00
